Genoma, Sequenciamento Completo

Novo teste que analisa 100% do genoma para detectar mutações na região codificante (éxons) e na região não-codificante (introns e elementos reguladores)

Até recentemente, o foco do diagnóstico genético clínico pela técnica de sequenciamento do DNA era na tentativa de identificar a causa de doenças gênicas testando apenas 2% do genoma humano, apenas a região dita “codificante” - o conjunto de éxons ao qual se dá o nome de exoma. Esta é uma excelente estratégia diagnóstica pois no exoma encontram-se 85% das mutações deletérias à saúde de um indivíduo. A análise limitada ao exoma tem um favorável custo / benefício em face da excelente relação esforço empreendido / informação obtível.

Porém, não é possível esquecer que 15% das mutações que afetam a saúde estão fora do exoma: estão nos restantes 98% do genoma humano.

A boa notícia é que, agora, estes “98% não-codificantes” do genoma  já podem ser sequenciados em conjunto, simultaneamente, ao exoma. E é possível ter acesso também aos 15% de mutações fora do escopo do teste do exoma codificante.

Detalhes importantes sobre as funções REGULADORAS da porção não-codificante do genoma humano têm emergido e mutações nos introns e outros elementos (enhancers, activators, insulators) podem ser deletérias por interferirem com a expressão de um gene normal, sem mutação. 

A situação, então, mudou. A demanda pelo novo teste aumenta no que pesem o alto custo de sequenciar todo o genoma (composto por 3 bilhões de pares de bases), o tamanho dos arquivos gerados* e o desafio da interpretação clínica da imensa quantidade de dados.

*O volume de dados gerados pelo sequenciamento do exoma (2% do genoma apenas) é 5-6 Mb. E cerca de  50 mil mutações são encontradas, necessitando ser filtradas e analisadas para definir as que são relevantes para o quadro clínico do(a) paciente.

**O aumento de volume de dados gerados pelo sequenciamento de 100% do genoma é exponencial: 90 Gb! E são detectadas cerca de 2,5 milhões de mutações (entre elas as 50 mil do exoma)!

 O Brasil continua a acompanhar os avanços da medicina científica internacional e neste cenário se encaixa a iniciativa do Professor Doutor Sérgio Pena e do Laboratório GENE de introduzirem em nosso país Sequenciamento Clínico Completo do Genoma TOTAL.  A interpretação dos dados é realizada pessoalmente por ele, médico geneticista de notório saber e experiência, e o prazo de resultado do teste de 100% do genoma é o mesmo do teste do exoma (cerca de 90 dias). Neste prazo está incluído o período necessário para complementar o exame e VALIDAR gratuitamente, no DNA dos pais, mutações novas potencialmente relevantes.

Observação: a validação de mutações novas, ainda não descritas, é realizada GRATUITAMENTE pelo Laboratório GENE.


PERGUNTAS FREQUENTES E SUAS RESPOSTAS

Pergunta: Em quais situações o Sequenciamento Clínico Completo Total de 100% do Genoma é importante?

Resposta: Sempre que o diagnóstico do(a) paciente se mantiver elusivo, em especial após a realização do sequenciamento do exoma.

Pergunta: Como e por que os 15% de mutações fora da porção codificante do genoma, fora do exoma, podem influenciar a saúde?

Resposta: Mutações nas diferentes classes de elementos funcionais (introns), estruturais (cromatina) e regulatórios (enhancers, activators, insulators) - fora dos éxons - interferem com a saúde quando impedem a correta expressão gênica. O gene em si não apresenta mutação mas não é expressado adequadamente. O diagnóstico desta nova classe de mutações, agora possível graças à disponibilização do Sequenciamento Clínico Completo do Genoma TOTAL, tem permitido esclarecer a causa de doenças genéticas antes inexplicáveis.

Pergunta: É verdade que só o sequenciamento total de 100% do genoma humano permite efetivamente sequenciar completamente os éxons, devido às limitações técnicas inerentes ao processo de sequenciamento focalizado só no exoma?

Resposta: Na atualidade, por razões técnicas, há reconhecidas limitações na eficiência da captura dos éxons. E há variações de profundidade de leitura dos éxons. Assim, não é possível garantir que serão detectadas todas as mutações de todos os éxons, apesar de ser esta a intenção do teste do exoma. Ao sequenciar TODO o genoma (100%) - sem ter de “selecionar” os éxons codificantes - TODA a informação genética será obtida. Assim, pode ser dito que sequenciar 100% do genoma é uma forma garantida de sequenciar todo o exoma.

Pergunta: Então é melhor já testar o GENOMA TOTAL em vez de começar pelo sequenciamento do exoma?

Resposta: Não. No momento o custo-benefício do teste do exoma (metade do preço do teste do genoma total) ainda o mantém como a melhor opção: testa-se 2% apenas do genoma total para obter grande quantidade de informação sobre 85% das mutações deletérias. Porém, quando o teste dos éxons pela metodologia atual não permitir um diagnóstico, é importante saber que já é possível prosseguir a busca da causa da doença genética e testar 100% do genoma.

Isto é um alento para as famílias e um estímulo para a comunidade médica pois é sabido que o teste só do exoma ainda deixa sem diagnóstico a etiologia da doença de 40-50% dos pacientes: o sequenciamento do genoma total poderá detectar mutações nos próprios éxons - que não foram identificadas no teste do exoma por limitações inerentes à metodologia e também por limitações interpretativas - ou desvendar mutações na região não pesquisada. O crescente número de publicações científicas sobre a associação de anomalias congênitas com variantes nas regiões não-codificantes do genoma comprova a utilidade do teste mais completo.

Detalhes adicionais:

Enquanto as mutações deletérias nos éxons, nos próprios genes, interferem com os aminoácidos e com a precisão do splicing (processo que remove introns e junta os éxons, depois da transcrição do RNA), alterando a função ou o nível do produto gênico (proteínas), o entendimento atual é de que variantes fora dos éxons, nos elementos regulatórios, levam ao aparecimento de fenótipos alterados devido à expressão anômala de um gene cujo sequenciamento foi normal.

É grande o volume de mutações nos elementos regulatórios das funções dos genes como os chamados enhancers (facilitadores, realçadores, potenciadores da expressão gênica). Há centenas de milhares de enhancers  no genoma humano, alguns nos éxons mas a maioria nos introns. Muito pequenos (50-1500pb apenas), eles se ligam aos activators (ativadores) para facilitar a transcrição de um gene em RNA mensageiro, “abrindo” a dupla hélice do DNA para melhorar a ligação das proteínas. Neste ambiente, são também relevantes os insulators (isoladores), que limitam a interação dos enhancers com os promotores.

O insulator determina quais genes o enhancer pode influenciar e a sua presença é essencial quando dois genes adjacentes, em um mesmo cromossomo, têm padrões de transcrição muito diferentes: ele forma uma barreira e impede que os mecanismos de indução ou de repressão de um gene afetem o gene vizinho. Os insulators também podem impedir que a heterocromatina de um gene silenciado se espalhe até um gene que tem transcrição ativa. É fácil perceber que, se estes elementos não estiverem atuando corretamente, as repercussões serão importantes.

No câncer, têm sido descritos muitos transtornos, muitos distúrbios regulatórios, nas regiões não-codificantes das células somáticas, o que torna cada vez mais importante estudá-las com o teste do Sequenciamento Clínico Completo do Genoma TOTAL, um caminho já disponível aqui e agora. 

Além disto, parte da importância dos elementos regulatórios do genoma deriva também do fato de que variantes na região não-codificadora do genoma predispõem geneticamente a uma série de condições como doenças cardíacas, diabetes, câncer e obesidade.

Leia abaixo uma mensagem do Dr. Sérgio Pena, nosso Diretor Científico, preparada para os colegas médicos sobre o Sequenciamento Completo do GENOMA TOTAL. 

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TIPO E QUANTIDADE DE MATERIAL

4 ml de sangue EDTA + amostra dos pais (sangue em EDTA ou células bucais)

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PRAZO DE ENTREGA


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Sequenciamento Clínico Completo do GENOMA TOTAL


Prezados colegas,

É um prazer informar sobre o novo avanço introduzido agora em 2016 pelo Laboratório GENE, de forma pioneira no Brasil: o teste do SEQUENCIAMENTO CLÍNICO COMPLETO DO GENOMA TOTAL.

O prazo de resultado do teste é o mesmo do Sequenciamento Completo do EXOMA, mesmo computando-se o maior desafio do novo Sequenciamento Clínico Completo do GENOMA TOTAL, que inclui lidar com o aumento expressivo da quantidade de informação (90Gb de dados do sequenciamento do genoma em comparação com 5-6Mb do sequenciamento do exoma, que é 2% do genoma apenas), um fato que sem dúvida complica o armazenamento dos dados e a análise bioinformática.

O SEQUENCIAMENTO CLÍNICO COMPLETO DO GENOMA TOTAL tem vantagens importantes em relação à análise limitada dos exons:

1) O sequenciamento de todo o genoma evidentemente cobre 100% dos exons, ao contrário do teste só do exoma, que tem profundidade de leitura irregular, causada por imperfeições inerentes ao processo de captura dos exons.

2) Permite a detecção de mutações nas regiões de controle de expressão gênica (regiões promotoras e enhancers) e mutações no interior dos íntrons.

3) Facilita o diagnóstico de variações patológicas de número de cópia (CNVs).

4) Não é afetado por vários vieses apresentados pelo sequenciamento só do exoma, como o viés de referência, ou seja, o enriquecimento do alelo de referência em sítios heterozigóticos.

A única desvantagem do Sequenciamento Clínico Completo do Genoma Total é seu preço mais elevado, o dobro do valor do teste do exoma.

Destaco que o já bem divulgado e aceito Sequenciamento Completo do Exoma - que revolucionou a medicina diagnóstica - continua a ser o método de escolha para a tentativa inicial de elucidação da etiologia genética de doenças mendelianas não-diagnosticadas e/ou raras, pois nos exons residem 85% das variantes causadoras de doenças. E a equipe do Laboratório GENE tem orgulho de apresentar a sua estatística de sucesso nos testes de Sequenciamento Completo do Exoma, que realiza desde 2013: as variantes patogênicas responsáveis pelo quadro clínico dos pacientes foram identificadas em mais de 50% dos nossos casos, contrastando com 30-40% de diagnósticos conclusivos reportados nas literaturas americana e europeia.

Entretanto, o SEQUENCIAMENTO CLÍNICO COMPLETO DO GENOMA TOTAL é uma nova e poderosa metodologia diagnóstica a ser considerada quando:

1) O Sequenciamento Completo do Exoma não detectou mutação relevante para o quadro clínico ou só detectou uma variante em doença recessiva.

2) Há um diagnóstico clínico de certeza mas o sequenciamento isolado de um gene específico ou de um painel de genes não detectou mutação ou só detectou a presença de uma única variante em uma doença recessiva.

3) Há uma suspeita de que a variante patogênica possa estar em uma região promotora, intrônica ou intergênica.

Havendo interesse em obter mais detalhes sobre o SEQUENCIAMENTO CLÍNICO COMPLETO DO GENOMA TOTAL, estamos à disposição.


Cordial abraço de,

Sérgio Pena

Diretor Médico/Laboratório GENE